مروری بر کاربردهای طیف سنجی رامان در مطالعات ساختاری پروتئین

مروری بر کاربردهای طیف سنجی رامان در مطالعات ساختاری پروتئین

مروری بر کاربردهای طیف سنجی رامان در مطالعات ساختاری پروتئین

جهت مطالعه بقیه مطالب پیرامون آزمون رامان اینجا کلیک کنید

چکیده

طیف سنجی رامان روشی مهم جهت شناسایی مولکول ها است که کاربرد زیادی در تعیین ویژگی های شیمیایی و ساختاری مواد مختلف دارد. بسیاری از مواد دارای طیف رامان ویژه ای می باشند به طوری که این پدیده دستگاه رامان را به ابزار کارآمدی برای مطالعه ویژگی های ساختاری و شیمیایی مولکول ها تبدیل نموده است. از آنجایی که می توان از طیف سنجی رامان اطلاعات دقیقی در مورد ویژگی های شیمیایی و ساختاری ترکیبات زیستی به دست آورد استفاده از این روش در حوزه علوم حیاتی و به ویژه در مطالعات زیست شناسی و پزشکی به سرعت در حال گسترش است. در مطالعه مواد به کمک دستگاه رامان نیازی به آماده سازی های خاص، زمان بر و پر هزینه نیست. در طیف رامان پروتئین، باندهای مشخص از حالات ارتعاشی ستون فقرات پپتیدی و زنجیره های جانبی آمینو اسیدی ناشی می شود. از این رو بر اساس موقعیت و شدت طیف رامان پروتئین، می توان به اطلاعات ارزشمندی در خصوص ساختارهای دوم، سوم و چهارم آن دست یافت. هم چنین طیف رامان پروتئین حاوی اطلاعاتی در خصوص نحوه جهت گیری و محیط اطراف زنجیره های جانبی آمینواسیدی است. تشکیل صحیح پیوند دی سولفیدی در ساختار پروتئین نیز به کمک دستگاه رامان قابل مطالعه می باشد. به طور کلی طیف رامان پروتئین ها حاوی باندهای متعدد گسسته است که نمایانگر حالات ارتعاشی مولکول می باشد و به عنوان اثر انگشت انتخابی برای تعیین دقیق ساختار سه بعدی پروتئین ها، پویایی درون مولکولی و برهمکنش های بین مولکولی استفاده می شود.

مقدمه
کاربرد طیف سنجی رامان اساساً در شناسایی مولکول ها است. امروزه همگام با پیشرفت های زیادی که در زمینه طراحی تجهیزات پژوهشی انجام شده است طیف سنجی رامان نیز بیش از پیش ساده تر، قابل دسترس تر و مقرون به صرفه تر شده است. البته با وجود پیشرفت های زیاد انجام شده، تفسیر طیف های رامان همچنان چالشی بزرگ و نیازمند به مهارت های خاص می باشد. همانند تمامی روش های طیف سنجی، طیف رامان نیز حاوی اطلاعات امواج الکترومغناطیسی برخورد کننده به نمونه است. پس از برخورد پرتوی الکترومغناطیسی به مولکول، بخشی از آن به تمامی جهات پراکنده می شود. طیف سنجی رامان برای مشاهده حالت های ارتعاشی ،چرخشی٣پ و دیگر حالات فرکانس پایین در یک سیستم به کار می رود. این نوع طیف سنجی به طور معمول یک اثر انگشت ساختاری ویژه فراهم می کند که برای شناسایی مولکول های مختلف استفاده می شود. در واقع این نوع طیف سنجی بر پایه پراکندگی غیر کشسان ۴) موسوم به پراکندگی رامان۵ (نور تکفام می باشد و پرتوهای تکفام نور رامان نیز معمولا نور لیزر در ناحیه مرئی، نور مادون قرمز نزدیک و یا نور فرابنفش نزدیک می باشند [١. ٢]

تاریخچه رامان

پراکنش غیرکشسان نور ضمن برخورد با ماده تا سال ١٩٢٨ گزارش نشده بود در حالی که این پدیده مهم فیزیکی اولین بار توسط آدولف اسمکال۶ در سال ١٩٢٣ پیش بینی شده بود. هم چنین اولین بار چاندراسخارا ونکتا رامان٧ این اثر را پس از مطالعه عبور نور خورشید از محلول های آلی مشاهده کرد و در سال ١٩٣٠ به واسطه این کشف مهم و دیگر مطالعاتش در این حوزه مفتخر به دریافت جایزه نوبل فیزیک گردید. توسعه و تکامل این اثر فیزیکی توسط جورج پلاکزیک٨ بین سال های ١٩٣٠ تا ١٩٣۴ انجام شد. هم چنین جان ویلیام ریلی٩ در سال ١٨٩٩ میلادی ضمن پیشنهاد فرضیه جدید توانست پراکندگی کشسان نور را توجیه کند. این تئوری پراکنش نور در واقع پاسخی به چرایی آبی بودن رنگ آسمان نیز بود. در آن زمان مطالعات پراکنش نور در کشورهایی نظیر روسیه، فرانسه، هند، ایالات متحده آمریکا و آلمان نیز به طور جدی دنبال می شد. در اوایل قرن بیستم میلادی افرادی مانند رامان و کریشنان١٠ در هند و لندزبرگ١١ و مندل اشتام١٢ در روسیه در این حوزه مطالعاتی پیشگام بوده اند. این افراد هنگام بررسی تغییر فرکانس نور پراکنش یافته در شرایط مختلف فیزیکی به نتایجی دست یافتند که در واقع از قبل برای آن برنامه ریزی نکرده بودند. لندربرگ و مندل اشتام پراکندگی نور را در کوارتز و چند کریستال دیگر نیز بررسی نمودند تا پرتوهای پراکنش یافته که در قیاس با نور ورودی دچار تغییر فرکانس شده اند را بیابند. در همان زمان رامان و کریشنان در هند و بسیار دورتر از دانشمندان روسی در حال بررسی تغییرات نور در اثر کامپتون١٣ بودند. آن ها با انتشار سه مقاله در سال ١٩٢٨ میلادی تغییر فرکانس نور پراکنش یافته ضمن برخورد با ماده را به نام خود ثبت کردند این در حالی بود که گزارش های رامان و کریشنان تنها کمی زودتر از گزارش دانشمندان روسی بود. امروزه مطالعات گسترده ای بر روی پراکنش نور ضمن برخورد با ماده انجام می شود و حجم بالای مطالعات و انبوه مقالات علمی انتشار یافته در مورد این کشف بیان کننده اهمیت ویژه این موضوع می باشد [١ ،٢.]

٣ اساس طیف سنجی رامان

فوتون ها اغلب ضمن برخورد با مولکول بازتابیده، جذب یا پراکنده می شوند. در طیف سنجی رامان، فوتون های نور تکفام (نور تک طول موج) بعد از برخورد به نمونه در جهات مختلف پراکنده می شوند. در واقع در طیف سنجی رامان فوتون های پراکنده شده از نمونه مهم می باشد. اغلب فوتون هایی که با مولکول برخود می کنند به طور کشسان پراکنده می شوند. به این نوع پراکندگی، اصطلاحاً پراکندگی ریلی می گویند که درآن فوتون های پراکنده شده از نمونه دارای انرژی یا طول موج یکسانی با فوتون هایی هستند که به نمونه برخورد می نمایند. در سال ١٩٢٨ چاندرا سخار ونکتا رامان، فیزیکدان هندی، پدیده موسوم به رامان را کشف نمود. در این پدیده انرژی یا طول موج پرتوی پراکنده شده به وسیله مولکول ها از طول موج پرتوی اولیه ای که به نمونه برخورد می کند متفاوت است. به این نوع پراکنش پرتوهای نور اصطلاحاً پراکندگی غیر کشسان می گویند. تقریباً از هر ده میلیون فوتون پس از برخورد به ماده تنها یکی به صورت غیر کشسان پراکنده می شود. هم چنین میزان تفاوت در انرژی یا طول موج نور پراکنده شده غیر کشسان به ساختار مولکولی ترکیب بستگی دارد. در واقع طیف سنجی رامان بر اساس تجزیه و تحلیل این تفاوت ها و با هدف تعیین ساختار مولکولی ترکیبات مختلف شکل گرفته است. تغییر طول موج و یا انرژی تابش اولیه اطلاعات بسیار مهمی از جنبش های مولکولی درون سیستم را دراختیار می گذارد. در پراکندگی رامان فوتون با ماده برخورد می کند و بعد از پراکنش طول موج آن به سمت طول می شود (شکل ١-الف). در این موج های بیش تر و یا کمتر جابجا نوع پراکنش پرتوها انتقال به طول موج های بیش تر غالب می باشد که به آن پراکندگی استوک رامان می گویند. هم چنین انتقال به طول موج های کمتر را پراکندگی ضد استوک رامان۵ می گویند [٢ ،٣.[ گزارش شده است که نسبت شدت پراکندگی ضد استوک به استوک با بالا رفتن دما افزایش می یابد. در واقع فوتون ورودی با ابر الکترونی پیوندهای گروه های عاملی برخورد می کند و الکترون ها را به یک حالت مجازی برانگیخته می کند. سپس الکترون از حالت مجازی به یک حالت ارتعاشی یا چرخشی برانگیخته باز می گردد (شکل ١-ب). این پدیده باعث می شود که فوتون مقداری از انرژی اش را از دست دهد و به صورت پراکندگی استوک رامان آشکار گردد. انرژی از دست داده شده ارتباط مستقیمی با هویت شیمیایی گروه عاملی، ساختار مولکولی متصل به آن، نوع اتم های مولکول و محیط اطراف آن دارد. از این رو طیف های رامان هر مولکول اختصاصی است و می توان از آن همانند “اثر انگشت” در تشخیص هویت شیمیایی ترکیبات مولکولی درون یک مایع، روی یک سطح و یا در هوا استفاده کرد [٣.[ ۴

اثر رامان

میزان اثر رامان با قطبش پذیری الکترون های مولکول رابطه مستقیم دارد. اثر رامان در واقع برهمکنش بین ابر الکترونی نمونه و میدان الکتریکی خارجی پرتوهای نور تکفام ورودی می باشد. این حالت یک ٨ ایجاد می کند که تشکیل آن به قطبش پذیری دوقطبی لحظه ای القا شده نمونه بستگی دارد. از آنجایی که نور لیزر مولکول را تحریک نمی کند، در مطالعات رامان هیچ گذار واقعی بین سطوح انرژی اتفاق نمی افتد. (با نوسانات از این رو سیگنال رامان از برخورد پرتوی نوری (فوتون ها بین مولکولی (فونون ها (نمونه به دست می آید. بررسی و تجزیه و تحلیل اطلاعات به دست آمده در طیف سنجی رامان به تعیین ساختار، اندازه گیری کیفی و در مواردی کمی مولکول های می انجامد. هم چنین مطالعه اثر بسیاری از پارامترهای مختلف فیزیکی از قبیل دما، فشار و تنش بر نوسانات بین اتمی و بین مولکولی برمی گردد. طیف پراکندگی رامان و طیف جذبی مادون قرمز یک مولکول دارای شباهت های زیادی با یکدیگر هستند که در واقع از شباهت های این دو روش ناشی می شود. هم چنین با وجود شباهت زیاد، این دو روش در اصول اولیه با همدیگر متفاوت می باشند به نحوی که معمولا به عنوان روش های مکمل یکدیگر استفاده می شوند. در جذب مادون قرمز میزان انرژی جذب شده از فوتون ورودی با اختلاف انرژی بین حالت های چرخشی-ارتعاشی آغازی و پایانی مطابقت دارد در حالی که در پراکنش رامان میزان انرژی فوتون ورودی با خروجی یکسان نیست (معمولا بیش تر یا کمتر می باشد). هم چنین وابستگی رامان به قطبش پذیری گونه های دو قطبی-دوقطبی الکتریکی آن را از طیف سنجی مادون قرمز که تنها به گونه های دوقطبی لحظه ای الکتریکی وابسته است (تانسور قطبی اتمی (متمایز می کند. این تفاوت ها بیانگر آن است که انتقالاتی بین حالت های چرخشی- ارتعاشی ممکن است در جذب مادون قرمز فعال نباشد ولی با استفاده از طیف سنجی رامان قابل مطالعه است. عکس این پدیده نیز وجود دارد به طوری که طیف سنجی جذبی مادون قرمز در مواردی که طیف سنجی رامان برای مطالعه مولکول کاربردی ندارد استفاده می شود. بنابراین انتقالاتی که دارای شدت زیادی در طیف رامان باشند اغلب دارای جذب مادون قرمز ضعیفی هستند و بر عکس. به بیان دیگر ارتعاشی در طیف سنجی مادون قرمز فعال است که ضمن وقوع آن تغییری در دوقطبی لحظه ای مولکول دیده شود. همین طور ارتعاشی در طیف سنجی رامان فعال است که ضمن وقوع آن قطبش پذیری مولکول نیز تغییر کند. به عنوان مثال مولکول هایی با هسته های همسان نظیر N٢ ،H٢ و O٢ در مطالعه با رامان فعال هستند ولی در طیف سنجی مادون قرمز فعال نمی باشند. در مولکول CO٢ حرکت ارتعاشی متقارن در رامان فعال است و در مادون قرمز فعال نیست. برعکس حرکت ارتعاشی نامتقارن در رامان فعال نیست ولی در مادون قرمز فعال می باشد. بعضی ارتعاشات نیز هم در مادون قرمز و هم در رامان فعال می باشند.

جابجایی طیف رامان جابجایی های طیفی رامان به طور معمول به صورت عدد موج گزارش می شود که واحد آن عکس واحد طول موج است و مقدار آن مستقیماً به تغییرات انرژی مربوط می باشد. ∆ω = ( ١ λ٠ − ١ λ١ ) (١) در معادله فوق ω ∆جابجایی طیف رامان می باشد که به صورت عدد موج بیان می گردد، λ٠ طول موج برانگیختگی و λ١ طول موج طیف رامان است. واحدی که برای بیان عدد موج در طیف رامان استفاده ١ می باشد در حالی که طول موج به می شود معمولا عکس سانتی متر صورت نانومتر بیان می گردد. برای تبدیل این دو واحد به یکدیگر از معادله زیر استفاده می شود. (٢) ∆ω ( cm−١ ) = ( ١ λ٠ (nm) − ١ λ١ (nm) ) × ( ١٠٧nm) (cm) ۶

اجزای اصلی دستگاه رامان ،سیستم هر دستگاه رامان از چهار بخش اصلی شامل منبع نور لیزر ،انتخاب گر طول موج (فیلتر روشنایی نمونه و لنزهای جمع کننده نور ۵ تشکیل شده است. پس از برخورد نور و آشکارساز یا طیف سنج) لیزر به نمونه و پراکنش آن از سطح آن، نور پراکنش یافته به وسیله یک لنز جمع آوری می شود و به وسیله فیبری به واحد آشکارساز منتقل می گردد. طول موج های نزدیک به طول موج لیزر (پراکنش کشسان یا ریلی) به وسیله یک فیلتر مخصوص جذب می شوند. تنها پرتوهای پراکنش یافته ای که از منظر انرژی یا طول موج نسبت به نور ورودی تغییر یافته اند مجوز عبور می یابند و به آشکارساز می رسند.

متداول ترین منبع های مولد لیزر در دستگاه رامان لیزر آرگون با طول موج های ۴٨٨ و ۵١۴٫۵ نانومتر، لیزر کریپتون با طول موج های نزدیک به ۵٣٠ ،۵۶٨ و ۶۴٧ نانومتر، لیزرهلیم/نئون با طول موج ۶٣٢٫٨ نانومتر، لیزر دیودی با طول موج ٧٨۵ و ٨٣٠ نانومتر و لیزر AG Y/d N با طول موج ١٠۶۴ نانومتر می باشد. امواجی که پس از برخورد با نمونه و ضمن پراکنش دارای تغییر فرکانس (طول موج) می باشند همان سیگنال های رامان هستند که از اهمیت ویژه ای برخوردار هستند. سطح مقطع پراکندگی رامان بسیار کوچک است و سخت ترین مرحله در این روش جدا کردن پرتوهای کشسان ریلی از پرتوهای تغییر یافته فرکانسی رامان موسوم به پرتوهای غیرکشسان است. در گذشته از توری های هولوگرافیک و مراحل چندگانه برای حصول درجه بالایی از سیگنال رامان استفاده می شد که زمان جمع آوری را نسبتاً طولانی می کرد. امروزه از فیلترهای ناچ١ یا فیلتر لبه ای٢ و از اسپکتروگراف ها ۴ (یا طیف سنجی بر (انتقال دهنده محوری٣ ،تکفام ساز زرنی-ترنر ۶ برای تقویت ۵ و آشکارسازهای دستگاه بارجفت شده پایه تبدیل فوریه سیگنال رامان استفاده می شود [١ ،۴ ،۵.[ ٧

کاربردهای طیف سنجی

رامان همان طور که پیش تر اشاره شد طیف سنجی رامان در حوزه های مختلف کاربرد وسیعی دارد. در سالیان اخیر استفاده از طیف سنجی رامان در پزشکی، داروسازی، صنایع غذایی، علوم دفاعی و دیگر صنایع رشدی چشمگیر داشته است. با توجه به رویدادهای جهانی سال های اخیر ایجاد روش های تشخیص سریع تهدیدهای بیولوژیکی برای ارتش و امنیت ملی اهمیت زیادی دارد. در این میان طیف سنجی رامان به دلیل آنکه اطلاعات دقیق و سریعی از ترکیب مولکولی موجود در مواد زیستی را به روشی غیر مخرب فراهم می کند مورد توجه زیاد قرار گرفته است. در حال حاضر طیف سنجی رامان برای تشخیص مواد منفجره، عوامل جنگ های شیمیایی و باکتریایی و دیگر مواد خطرناک شیمیایی به کار می رود. به کمک این روش می توان نمونه ها را به روش غیر تماسی و غیر مخرب در درون بسته بندی های شفاف یا نیمه شفاف نیز بررسی کرد. بنابراین داروها و مواد مخدر را می توان از میان کیسه پلاستیکی حاوی آن ها بررسی نمود و به این ترتیب از آسیب به مدارک و شواهد جنایی یا آلوده شدن آن ها اجتناب ورزید. هم چنین می توان پروب٧ طیف سنجی رامان را به فیبر نوری مجهز نمود به گونه ای که نیترات، نیتریت و هیدروکسید را در مخازن حاوی پسماندهای رادیواکتیو اندازه گیری نماید. این سه ماده شیمیایی اغلب برای نمایش و کنترل خوردگی مخازن بکار می رود. به این ترتیب نیازی به برداشت فیزیکی نمونه از درون مخازن و خطرات حمل آن به یک آزمایشگاه ثابت جهت بررسی آن ها نمی باشد. دقت آشکارسازی رامان به عوامل مختلفی از جمله طول موج لیزری به کار رفته و نوع ماده بستگی دارد. دقت آشکارسازی این ٩ متغیر روش معمولا از چند بخش در میلیون٨ تا چند بخش در میلیارد می باشد. قابلیت رامان در نمایش تنش و پارامترهای دیگر مانند دمای سطح قطعه آن را به عنوان ابزاری مؤثر در ساخت قطعات نیمه رسانا مطرح می کند. هم چنین توانایی این روش در فراهم آوردن تصاویری دقیق از سلول ها، امکان مقایسه بین بافت های سالم و بیمار را فراهم می سازد که به ویژه در مطالعه بافت های سرطانی مهم است [٣ ،۴ ،۵.]

کاربرد رامان در بررسی ساختار پروتئین

چه اطلاعاتی از بررسی طیف پراکنش رامان مواد حاصل می شود؟ فرکانس های ارتعاشی یک پیوند حساسیت زیادی به جزئیات و ، ویژگی های ساختاری و محیط محلی مولکول نظیر فاز کریستالی تقارن ،مورفولوژی پلیمر موقعیت باند در طیف رامان نمایانگر گونه شیمیایی ،فاز کریستالی یا ماده مورد مطالعه می باشد. ترکیب و یا ترکیبات سازنده آلیاژ هم چنین شدت طیف رامان نشان دهنده غلظت گروه عاملی موجود در ترکیب و یا ماده مورد بررسی است. جابجایی فرکانسی رامان بیانگر نوع گروه عاملی و تغییرات دمایی در ماده مورد بررسی می باشد. و بالاخره پهنای طیف رامان نشان دهنده وجود اختلال یا بی نظمی ساختاری در ماده مورد مطالعه است. اطلاعاتی که از بررسی طیف رامان حاصل می شود به طور خلاصه در شکل ٣) الف) نشان داده شده است [٣ ،۴.[ ٩

طیف رامان پروتئین

١ باندهای آمیدی پروتئین

به طور کلی نه حالت عادی برای باندهای آمیدی پروتئین تعریف شده است. نام گذاری این حالات بر اساس کاهش فرکانس آن ها به صورت A و B و VII-I می باشد. باندهای آمید نوع I) ٨٠ درصد ۶٠) ٨ کشش O = C ،نزدیک ١−١۶۵٠cm ،(باند آمید نوع II (١۵۵٠cm−١ نزدیک C-N کشش درصد ۴٠ ،N-H خمش درصد N- خمش درصد ٣٠ ،C-N کشش درصد ۴٠) ٩ و باند آمید نوع III H نزدیک ١−١٣٠٠cm (برای مطالعه ساختار پروتئین به کار گرفته می شود (شکل ٣-ب). مفیدترین باندهای آمیدی که در بررسی ساختار و برهمکنش پروتئین ها به کار می رود باند های آمید نوع I و III می باشد. این باندهای آمیدی نه تنها شدت طیفی مناسب دارند بلکه حساسیت خوبی نیز نسبت به تغییرات ساختار دوم پروتئین از خود نشان می دهند. باندهای آمیدIوIII به ترتیب در فواصل طیفی ١−١۶٨٠cm−١۶۴٠ ١−١٣١٠cm − ١٢٣٠ قرار می گیرند. شکل و موقعیت بیشینه و طیفی باندهای آمید نوع I و III به ساختار دوم پروتئین حساس بوده و هر گونه تغییر در این ساختارها باعث تغییر در طیف این نواحی می شود. به طور کلی این دو ناحیه طیفی برای بررسی ساختار دوم پروتئین مناسب است.

I نوع آمیدی باند

در جدول ٢ فرکانس های مرتبط با هر یک از ساختارهای دوم پروتئین آمده است. پروتئین هایی که به میزان قابل توجهی دارای مارپیچ آلفا ١۶۵۵ − ١۶۵٠cm−١ هستند دارای یک باند آمید I قوی در ناحیه می باشند. کشش پیوند هیدروژنی در ساختار صفحات بتا به دلیل انعطاف پذیری و تمایل به چرخش بسیار متنوع است. از این رو برای ساختارهای بتای پروتئین یک باند قوی بین ناحیه − ١۶١٢ ١−١۶٨۵cm در نظر ١−١۶۴٠cm و یک باند ضعیف تر در حدود گرفته می شود. هم چنین باندهای ضعیف تر در فرکانس های پایین تر و ١−١۶٧٠cm − ١۶۵۵ نیز برای ساختار های بتای پروتئین در ناحیه مشاهده شده است. ساختارهای نامنظم نیز به طور معمول دارای یک باند در ناحیه نزدیک به ١−١۶۵۵cm می باشند (شکل ۴-الف).

II نوع آمیدی باند

تغییر در ارتعاشات خمشی پیوند H-N در تشکیل این باند نقش بیش تری دارد. جایگزینی دوتریوم١٠ با هیدروژن در مولکول آب باعث جابجایی به سمت فرکانس های پایین تر در باند آمید نوع II می شود. پپتیدها و پروتئین هایی که دارای صفحات موازی بتا ناهمسو می باشند در فاصله فرکانسی ١−١۵۵٠cm − ١۵٣٠ دارای ناحیه طیفی (باند) می باشند. استفاده همزمان از باندهای آمیدی نوع I و II در بررسی بهتر ساختار صفحات بتا و پیچه های نامنظم، اطلاعات مفیدتری را در اختیار قرار می دهد. همین طور در برخی موارد استفاده از باند آمید نوع II در کسب اطلاعات بیش تر و تخمین دقیق تر ساختارهای نامنظم و مارپیچ آلفا مفید است. به طور کلی باند آمید نوع
II به دلیل ضعیف بودن شدت آن به تنهایی برای بررسی ساختارهای دوم پروتئین مناسب نمی باشد.

III نوع آمیدی باند

همانند باند آمیدی نوع II جایگزینی دوتریوم با هیدروژن در مولکول آب موجب جابجایی آن به سمت فرکانس های پایین تر می شود ١−١٠٠٠cm − ٩۶٠ .(استفاده همزمان باند آمیدی نوع III با ) باند آمید نوع I به تفکیک بهتر ساختار صفحات بتا از ساختارهای نامنظم پروتئین کمک شایانی می کند. در باند آمیدی نوع I به تنهایی این تفکیک پذیری به خوبی امکان پذیر نیست (جدول ٣ .(با استفاده از باند آمید نوع III در کنار باند آمیدی نوع I می توان اطلاعات کاملی در مورد تغییرات ساختارهای دوم پروتئین ها به دست آورد (شکل ۴-ب) .[٣] جدول ٣ :فرکانس های مربوط به ساختارهای دوم پروتئین در باند آمیدی نوع III طیف رامان. H٢O (cm−١ ساختار دوم ( مارپیچ آلفا ١٣٠٠ − ١٢٧٠ صفحات بتا ١٢٣۵ − ١٢٢٩ پیچه نامنظم ١٢۵٣ − ١٢۴٣

٩ . ٢ سایر شاخص های مهم طیف رامان پروتئین

• پل های دی سولفیدی١) سیستئین و پیوند S-S( و • آمینواسیدهای آروماتیک٢) فنیل آلانین٣ ،تریپتوفان۴ ( تیروزین

٩ . ٢ . ١ پل های دی سولفیدی

در طیف رامان نتایج پژوهش های پیشین پیشنهاد می کند که پروتئین های دارای پل های دی سولفیدی (S-S (واجد باند رامان در ناحیه .(۵ شکل (هستند ۵۵٠ − ۵٠٠cm−١

٩ . ٣ موقعیت سیستئین پروتئین در طیف رامان

باند رامانی که در نتیجه ارتعاشات کششی پیوند سولفیدریل سیستئین ایجاد می شود یک شاخص ویژه از پویایی و ساختار محلی SH می باشد. ١−٢۶٠٠cm−٢۵٠٠ واقع شده است و از هرگونه این باند در ناحیه تداخل با باندهای دیگر رامان در امان می باشد. هم چنین این باند حساسیت ویژه ای برای پیوند هیدروژنی گروه های سولفیدریل پروتئین از خود نشان می دهد (جدول ۴ .(از آنجایی که این باند مختص گروه SH است از شدت طیف آن برای اندازه گیری غلظت سولفیدریل سیستئین استفاده می شود [٣ ،۶.[ شکل ۵ :طیف رامان پیوندهای دی سولفیدی پروتئین لیزوزوم در (الف) بازه های زمانی و (ب) دماهای مختلف [١۴[

٩ . ۴ موقعیت آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین در طیف رامان

ارتعاشات پیوندی آمینواسیدهای آروماتیک نسبت به تغییرات محیطی حساسیت زیادی نشان می دهد. بنابراین هر گونه تغییر در محیط موجب تغییر در باند مربوط به این آمینواسیدها می شود. جدول ۵ باندهای مربوط به تعدادی از آمینواسیدها را نشان می دهد.

٩ . ۵ موقعیت فنیل آلانین پروتئین در طیف رامان

.باشد می ١٠٠٠(cm−١ فنیل آلانین دارای یک باند قوی در ناحیه ( از آنجایی که این باند به تغییرات ساختاری پروتئین حساس نیست از آن می توان برای نرمال سازی١ طیف رامان پروتئین استفاده کرد (شکل ۶-الف).

٩ . ۶ موقعیت تریپتوفان پروتئین در طیف رامان

تریپتوفان دارای دوگانه فرمی٢ در نواحی ١−١٣۴٠cm و ١−١٣۶٠cm می باشد. از نسبت شدت طیف در این دو ناحیه (I١٣۴٠/I١٣۶٠ (به عنوان شاخص جهت نمایش وضعیت آبگریزی محیط اطراف این آمینواسید استفاده می شود. هنگامی که تریپتوفان ١−١٣۶٠cm قوی از خود نشان در محیط آب گریز قرار باشد باند می دهد و این نسبت به بیش از ١٫١ می رسد (١٫١ > I١٣۴٠/I١٣۶٠.( ١−١٣۴٠cm قوی تر اگر محیط اطراف تریپتوفان آبدوست باشد باند می شود و لذا این نسبت کمتر از ٠٫٩ می شود (٠٫٩ < I١٣۴٠/I١٣۶٠.( باند در موقعیت ١−١٠١٠cm نسبت به برهمکنش واندروالس حلقه تریپتوفان با باقی مانده های آمینواسیدی حساس می باشد. در واقع ١−١٠١٠cm نشان دهنده باند در فرکانس های نزدیک و کمتر از نبود برهمکنش واندروالس و یا برهمکنش بسیار ضعیف واندروالس می باشد. هم چنین باند در فرکانس های نزدیک و یا بزرگ تر از ١−١٠١٢cm نشان دهنده برهمکنش قوی بین حلقه تریپتوفان و باقی مانده های آمینواسید موجود در محیط می باشد (شکل ۶-ب).

٩ . ٧ موقعیت تیروزین پروتئین در طیف رامان ١−٨۵٠cm

قرار گرفته فرمی دوگانه تیروزین در نواحی ١−٨٣٠cm و است و این باندها به موقعیت پیوند هیدروژنی حلقه فنیل در زنجیره جانبی بستگی دارد (شکل ۶-ج). نسبت I٨٣٠/I٨۵٠ برای باقی مانده آمینواسیدی تیروزین به صورت زیر قابل تفسیر می باشد.

هنگامی که این نسبت ۶٫٧ باشد تیروزین هیچ پیوند هیدروژنی در حلقه فنیل خود با گروه دیگری ندارد. هنگامی که این نسبت ٢٫۵ باشد گروه هیدروکسیل تیروزین یک پیوند هیدروژنی قوی به عنوان گیرنده بر قرار کرده است. نسبت ٠٫٣ نیز نشان دهنده آن است که گروه هیدروکسیل تیروزین به عنوان دهنده در یک پیوند هیدروژنی نقش ایفا می کند. هم چنین نسبت ١٫٢۵ نشان دهنده آن است که گروه هیدروکسیل تیروزین هم به عنوان دهنده وهم به عنوان گیرنده پیوند هیدروژنی عمل می کند. ١٠ اثر محیط بر طیف رامان پروتئین در پایداری ساختار طبیعی پروتئین پیوندهای هیدروژنی، پیوندهای دی ١ نقش مهمی سولفیدی، برهمکنش های یونی و برهمکنش های آبگریز دارند. تمامی این برهمکنش ها می تواند تحت تاثیر عوامل محیطی نظیر حلال، دما، pH و غلظت نمک قرار گیرد و در نهایت موجب تغییر ساختار پروتئین شود. این تغییرات ساختاری را می توان در طیف رامان مشاهده و دنبال کرد. هم چنین طیف سنجی رامان امکان مطالعه تاخوردگی صحیح و نا صحیح پروتئین ها را به خوبی فراهم می کند. ١١ اثر pH بر طیف رامان پروتئین تغییرات pH محیط با تغییر یونیزاسیون٢ زنجیره های جانبی پروتئین موجبات اختلال در پیوندهای هیدروژنی طبیعی و بر هم خوردن ساختار و ٣ پروتئین ها می شود. همان طور که در شکل ٧ مشاهده می شود الوپولا همکاران در سال ٢٠٠۶ اثر pH را بر روی ساختار پروتئین گلوبین برنج مطالعه کرده اند. مطالعه این پژوهشگران نشان داده است که تغییرات pH باعث جابجایی اندک باندهای آمید I و III می شود. این پدیده نیز خود بیانگر انتقال از ساختار مارپیچ آلفا به ساختار های موسوم به صفحات بتا و ساختار های نامنظم پروتئین می باشد (شکل ٧.( ١٢ اثر دما بر طیف رامان پروتئین دماهای بسیار بالا و پایین می تواند موجب تضعیف و یا از بین رفتن برهمکنش های پایدار کننده ساختار پروتئین شوند. اختلال در این برهمکنش ها ساختارهای دوم و سوم پروتئین را شدیداً متأثر می کند و در نهایت ساختار طبیعی آن را از بین می برد که ممکن است به توده ای شدن پروتئین نیز منجر شود. همان طور که در شکل ٨ مشاهده می شود افزایش دما موجب جابجایی باندهای آمیدی نوع I و III می شود که نشان دهنده افزایش صفحات بتا در ساختار پروتئین است .[٧ ،۶ ،۵ ،۴ ،٣]

٣ اثر حلال بر طیف رامان پروتئین پروتئین در حالت محلول دارای طیف رامان پهن تری نسبت به حالت پودری می باشد. شکل ٩ طیف رامان پروتئین لیزوزیم را در دو حالت پودری و محلول نشان می دهد. همان طور که در این شکل مشاهده می شود باندهای آمید نوع III پروتئین در حالت محلول دارای طیف پهن تری می باشند [٨.[ ١۴ اثر واکنش های شیمیایی بر تاخوردگی و طیف رامان پروتئین ها همان طور که در شکل ١٠ آماده است در حضور غلظت های مختلف متانول باند آمیدی نوع I پروتئین آلفا سینوکلئین تغییر یافته است. ١ (و بررسی دقیق این ناحیه پس از تفکیک سطح زیر طیف (دکانووله مشخص می شود که ساختار پروتئین آلفا سینوکلئین تحت تاثیر متانول کم کم از حالت طبیعی خارج می شود و در آن ساختارهای دوم از مارپیچ آلفا به ساختارهای موسوم به صفحات بتا و ساختارهای نامنظم جابجا می شوند. ١۵ اثر عوامل احیا کننده بر تاخوردگی پروتئین ها و نمایش آن در طیف رامان همان طور که در شکل ١١ مشاهده می کنید پس از دکانوله کردن طیف های رامان پروتئین میزان تغییرات ساختاری در حضور عوامل احیا کننده تعیین می شود. پارمترهای فیزیک همچون سرعت واکنش، آنتالپی آزاد و انرژی فعال سازی را می توان از این داده ها محاسبه کرد .[١٠ ،٩] ١۶ تداخل در طیف رامان پروتئین به وسیله نشر فلورسانس و اثر سیگنال به نویز ١۶ . ١ نشر فلورسانس نشر فلورسانس می تواند اثرات مخرب شدیدی بر روی طیف رامان پروتئین داشته باشد. فلورسانس ذاتی معمولا در حضور آمینواسیدهای آروماتیک ایجاد می شود که با انتخاب طول موج برانگیختگی مناسب می توان این نشر را در مطالعات رامان پروتئین حذف کرد. هم چنین فلورسانس عارضی معمولا در اثر ناخالصی، حلال و یا بافر ایجاد می شود. برای اجتناب از تداخل فلورسانس عارضی در مطالعات رامان ضروری است نمونه ها تا جایی که امکان دارد به صورت خالص ٢ می توان از میزان تهیه شود. با خاموش کردن یا سفید کردن توسط نور نشر فلورسانس پس زمینه کم کرد. البته باید توجه داشت که افزایش دما در این حالت ممکن است به نمونه آسیب برساند

نسبت بالای سیگنال به نویز در حضور نسبت بالاتر سیگنال به نویز، طیف رامان نمونه از دقت بیش تری برخوردار است. همان طور که در شکل ١٢ مشاهده می شود می توان با افزایش تعداد اسکن و یا بالا بردن زمان اسکن این نسبت را افزایش داد. ضمناً باید توجه داشت که افزایش بیش از حد تعداد اسکن و هم چنین تغییر بازه زمانی اسکن می تواند به نمونه آسیب جدی وارد نماید [٧.[ ١٨ نتیجه گیری نهایی روش طیف سنجی رامان بر اساس دریافت اطلاعات از پدیده پراکنش نور ضمن برخورد با ماده استوار است. امروزه این روش کاربردهای زیادی در حوزه های مختلف پژوهشی دارد. هم چنین این روش اطلاعات مهمی از ساختار مولکول ها در اختیار می گذارد به طوری که باندهای رامان را می توان به نوعی اثر انگشت یک ترکیب دانست. شباهت ها و تفاوت های روش پراکنش نوری رامان با روش طیف سنجی جذبی مادون قرمز باعث شده است تا از این دو روش برای مطالعه دقیق تر ساختاری یک ترکیب و به صورت مکمل یکدیگر استفاده شود. طیف سنجی رامان اطلاعات بسیار ارزشمندی از ساختارهای دوم، سوم و حتی چهارم پروتئین در اختیار می گذارد. به کمک این روش می توان تشکیل صحیح پیوندهای دی سولفیدی را نیز در ساختار پروتئین بررسی نمود. هم چنین میزان اطلاعات قابل دریافت از طیف رامان پروتئین به مراتب بیش تر از دیگر روش های طیف سنجی مرسوم می باشد. از این رو طیف سنجی رامان به عنوان ابزاری سودمند جهت مطالعه ساختاری دقیق تر پروتئین پیشنهاد می شود. مراجع [1] Butler, H. J., et al. (2016). “Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.” Nature Protocols 11: 664. [2] Downes, A. and A. Elfick (2010). “Raman spectroscopy and related techniques in biomedicine.” Sensors (Basel) 10 (3): 1871-1889. [3] Nemecek, D., et al. (2013). “Raman Spectroscopy of Proteins and Nucleoproteins.” Current Protocols in Protein Science, 71(1): 11-17. [4] Tarcea, N., et al. (2007). “UV Raman spectroscopy-a technique for biological and mineralogical in situ planetary studies.” Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 68(4): 1029-1035. [5] Hammes, G. G. (2005). “Spectroscopy for the Biological Sciences.” [6] David, C., et al. (2009). “Protein S–S bridge reduction: a Raman and computational study of lysozyme interac

نویسندگان: محمدباقر شاهسونی و رضا یوسفی

فصل نامه علمی شاعا

یک دیدگاه در “مروری بر کاربردهای طیف سنجی رامان در مطالعات ساختاری پروتئین

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *